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想转质检管理岗 先培训拿下食品化妆品水质检验员证书-微生物检验操作技术

微生物检验操作技术是整个检验工作的核心，直接决定了检验结果的准确性和可靠性。以下按照检验流程的先后顺序，系统梳理各项关键操作技术：

无菌操作技术

无菌操作是微生物检验的第一基本功，贯穿整个检验过程，目的是防止外源性微生物污染样品，同时保护操作人员安全。

基本原则

• 操作前用75%酒精擦拭双手，待酒精完全挥发后再操作

• 所有操作必须在酒精灯火焰周围或超净台/生物安全柜内进行

• 明确区分无菌区和非无菌区，严禁交叉接触

• 吸管尖部不得触及任何非无菌表面（试管口、平皿边缘等）

• 吸取菌液必须使用吸耳球，严禁口吸

操作要点

• 打开试管塞/瓶盖时，管口和瓶口须通过火焰消毒

• 接种环/针使用前后必须在火焰上灼烧至发红灭菌，冷却后方可接触菌液

• 金属器具（镊子、剪刀）可用95%酒精浸泡后火焰烧灼3次灭菌

• 操作过程中尽量减少说话，避免飞沫污染

消毒灭菌技术

湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）

最常用的灭菌方法，适用于培养基、稀释液、玻璃器皿、工作服等。

• 常规条件：121℃，15–30分钟（根据物品体积和性质调整）

• 操作步骤：

1.     加水至规定液位（手提式3L，立式16L）

2.     放入物品，不超过锅内容积的80%，物品间不能过挤

3.     盖好顶盖拧紧，打开排气阀排出冷空气（水沸后排气10–15分钟）

4.     关闭排气阀，升压至规定值，维持规定时间

5.     固体物品：达到时间后开阀排气，压力归零后开盖取物

6.     液体物品：不可开阀排气，直接撤去热源，自然冷却至60℃以下再开盖（防止液体暴沸）

干热灭菌

适用于玻璃器皿、金属器具等耐高温不耐湿的物品。

• 条件：160–180℃，2小时

• 物品须用牛皮纸或铝箔严密包扎

• 灭菌结束后待温度降至60℃以下方可开柜取物

紫外线消毒

适用于无菌室、超净台等环境的空气和表面消毒。

• 30W紫外灯，距离工作台1米，照射时间不少于30分钟

• 灯管每隔两周用酒精棉球擦拭，去除灰尘和油垢

• 操作人员严禁在紫外线下直接暴露

培养基配制技术

配制流程

1.     称量：按说明书比例准确称取培养基干粉

2.     溶解：先用部分蒸馏水搅拌均匀，再加入剩余水量（避免结块）

3.     调pH：用pH计检测，必要时用NaOH或HCl调节至规定值

4.     分装：根据需要分装至试管、三角瓶等容器

5.     灭菌：塞好棉塞或盖好瓶盖，按规定条件灭菌

6.     倒平板：灭菌后冷却至约45–50℃（手感温热不烫手），在超净台内无菌操作倾注平皿

关键注意事项

• 配制时必须充分混匀后再灭菌，建议使用振荡器混匀

• 倒平板时培养基温度不可过高（>50℃会产生过多冷凝水），不可过低（<45℃会提前凝固）

• 倒完平板后，水平静置"左5圈右5圈"缓慢混匀（速度要慢，防止培养基溅到皿盖缝隙造成污染）

• 凝固后倒置放入培养箱，防止冷凝水滴落污染培养基表面

样品处理技术

液体样品

• 检验前充分摇匀（装满容器翻转25次；未装满则7秒内以750px幅度摇动25次）

• 用无菌吸管吸取规定量，加入稀释液或培养基中

• 吸管插入深度不超过62.5px，不得将吸有样品的吸管浸入培养基内

固体/半固体样品

• 用灭菌刀、剪取不同部位共25g样品

• 置于225mL灭菌生理盐水或缓冲蛋白胨水中（1:10稀释）

• 用均质器均质处理（一般8000–10000转/分钟，1–2分钟）

• 从均质到稀释接种，间隔时间不超过15分钟

稀释操作

• 采用10倍梯度稀释法：吸取1mL样液加入9mL无菌稀释液中，即为10⁻¹稀释度

• 每递增一个稀释度需更换吸管

• 吸取稀释液时，吸管尖不得触及稀释液管壁

• 每个稀释度建议做2–3个平行平板

接种技术

接种是将微生物转移至培养基上的核心操作，根据目的不同有多种方法。

平板划线法（分离纯化）

• 用接种环蘸取菌液，在平板表面分区划线（四区划线法最常用）

• 第一区密集划线→烧环冷却→第二区与第一区交叉2–3次后划线→依次类推

• 目的：通过逐步稀释，最终在第四区获得单个菌落

• 接种环与平板表面保持30–40°角

涂布法（计数）

• 用无菌吸管吸取定量菌液（通常0.1mL）滴加到平板中央

• 用无菌L形玻璃棒均匀涂布整个平板表面

• 适用于菌落计数和药敏试验

倾注法（计数）

• 吸取定量菌液加入无菌空平皿中

• 倒入约15mL冷却至45℃的琼脂培养基

• 迅速旋转混匀，静置凝固

• 适用于菌落总数、霉菌酵母计数

穿刺接种

• 用直接种针蘸取菌种

• 从半固体培养基中心垂直刺入，接近管底但不穿透

• 沿原路缓慢拔出

• 用于观察细菌动力和厌氧培养

染色技术

革兰氏染色（最核心的鉴别染色）

这是区分革兰氏阳性菌（紫色）和革兰氏阴性菌（红色）的经典方法。

1.     涂片：取菌液涂布于载玻片上，自然干燥

2.     固定：载玻片快速通过酒精灯外焰3次（或甲醇固定）

3.     初染：滴加结晶紫，染色1分钟，水洗

4.     媒染：滴加碘液（卢戈氏碘液），作用1分钟，水洗

5.     脱色：95%酒精脱色15–30秒（关键步骤，时间过长假阴性，过短假阳性），水洗

6.     复染：滴加沙黄或番红，染色30秒–1分钟，水洗

7.     镜检：油镜下观察，紫色为G⁺，红色为G⁻

其他常用染色

• 芽孢染色：鉴别产芽孢细菌（芽孢呈绿色，菌体呈红色）

• 抗酸染色：鉴别分枝杆菌（抗酸菌呈红色）

• 负染色（墨汁染色）：观察荚膜和真菌形态

培养技术

培养条件控制

培养观察要点

• 培养期间勤观察，记录温度是否稳定、培养基颜色变化、菌落生长情况

• 厌氧培养需确认厌氧指示剂变色正常

• 培养箱内平皿应倒置放置，防止冷凝水滴落

菌落计数技术

计数原则

• 选择菌落数在30–300 CFU之间的平板进行计数（霉菌为10–150 CFU）

• 同一稀释度做2–3个平行平板，取平均值

• 菌落蔓延覆盖平板面积超过一半时，该平板不计入结果

计数方法

• 手动计数：使用菌落计数器，逐一点数并标记

• 分区计数：平板菌落过多时，将平板分为4–8个区域，分别计数后求和

• 结果报告：取两个连续稀释度的平板计数结果，按标准公式计算

废弃物处理技术

所有带菌废弃物必须先灭菌后处理，严禁直接排放。

• 培养后的培养基、平皿等：121℃高压灭菌30分钟后丢弃

• 染菌吸管：浸泡于5%煤酚皂溶液中≥24小时，再高压灭菌

• 菌液洒落：立即用5%石炭酸或3%来苏尔覆盖污染区域≥30分钟，再清理

• 污染工作服：放入专用消毒袋，高压灭菌后方可洗涤

📌 操作技术要点总结

💡 实操建议：微生物检验操作技术的学习，"看十遍不如做一遍"。建议在学习理论的同时，尽早进入实验室进行实操训练，尤其是无菌操作和接种技术，需要反复练习形成肌肉记忆。