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无菌微生物检验员证书报考资讯微生物检验员培训报名官网-蒸汽灭菌规范流程

一、引言

在微生物学实验、组织培养及各类科研工作中，灭菌环节至关重要，直接关系到实验结果的准确性和可靠性。高压蒸汽灭菌锅作为常用的灭菌设备，其操作规范与常见错误的避免，对于确保灭菌效果、保障实验安全意义重大。

二、高压蒸汽灭菌锅操作规范

（一）操作前准备

1.     检查设备：确保高压蒸汽灭菌锅外观无损坏，各部件连接紧密，安全阀、压力表等关键部件正常。

2.     加水：向灭菌锅内加入适量水，一般应加至指定水位线，通常为 2 - 3L，以保证蒸汽的产生。

3.     装载物品：将待灭菌物品合理放置在消毒筒内，注意物品之间应留有适当空隙，避免堆积过紧、过满，保证蒸汽的流通和热交换。对于试管、三角瓶等容器，装的溶液量应少于 2/3。

（二）排气操作

1.     连接排气软管：将排气软管按要求插入灭菌筒的下部，确保连接牢固，防止断裂、缺失。

2.     排气：在升压前，打开排气阀，让锅内冷空气充分排出。一般要等到水煮沸，排出一分钟左右的蒸汽后再把安全阀关闭。这是因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度，若排气不彻底，会影响灭菌效果。

（三）升压与灭菌

1.     关闭排气阀：排气结束后，关闭排气阀，使锅内压力逐渐上升。随着压力的增加，水的沸点升高，蒸汽温度也随之升高。

2.     控制升压速度：压力表指针在 0.05MPa 以上时，不能过快放汽，以防止压力急速下降，液体滚沸，从培养容器中溢出。同时，升温不宜过快，以免被灭菌物体内部升温滞后于压力表指示温度，影响灭菌效果。

3.     达到灭菌条件：当压力表指针达到规定压力（如 0.105MPa，对应温度 121℃）时，开始计时，保持该压力和温度一段时间（通常为 15min），以达到灭菌目的。

（四）降压与取物

1.     自然降压：灭菌结束后，应让灭菌锅自然降压，不能在压力未降到 0 时，强行打开排气阀或锅盖。如果压力未降到 0 时打开排气阀，锅内压力突然下降，会使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

2.     打开锅盖：待蒸汽放尽后，小心打开锅盖，取出灭菌后的物品。如果灭菌后的培养基在锅内不及时拿出，需在蒸汽放尽后将锅盖打开，切忌将培养基封闭在锅内过夜，以免培养基变质。

（五）安全注意事项

1.     防止烫伤：操作过程中，要注意安全，小心烫伤。因为高压蒸汽锅的温度较高，蒸汽和设备表面都可能造成烫伤。

2.     定期维护：定期对高压蒸汽灭菌锅进行维护和校准，确保其性能稳定，安全阀、压力表等部件准确可靠。

三、高温灭菌原理及湿热灭菌优势

（一）高温灭菌原理

高温灭菌是指用热能杀死微生物，其原理是高温使原生质中的蛋白质变性、使酶失活，致使微生物死亡。

（二）湿热灭菌优势

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：

1.     蛋白质凝固：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。

2.     穿透力强：湿热的穿透力比干热大，能够更有效地作用于微生物。

3.     潜热存在：湿热的蒸汽有潜热存在，每 1 克水在 100℃时，由气态变为液态时可放出 2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

四、高压蒸汽灭菌锅操作常见错误分析

（一）排气不彻底

1.     原因：在升压前未将锅内冷空气排净，空气是热不良导体，若不排净，冷空气会聚集并滞留在灭菌锅中消毒筒的中下部，围绕在待灭菌物的周围。

2.     后果：假若锅内仅排除一半空气，当压力表指针达到 105Pa 时，锅内实际温度仅能达到 112℃，比要求的 121℃低 9℃之多，将导致灭菌不彻底，可能造成大面积染菌。

（二）排气软管问题

1.     原因：排气软管没有按要求插入灭菌筒的下部，或排气软管断裂、缺失。

2.     后果：灭菌锅内的冷空气无法通过排气软管排出，灭菌锅内的空气排放受阻，蒸汽直接经排气阀排出锅外。

（三）物品堆积问题

1.     原因：消毒筒内物品堆积太紧、太满。

2.     后果：阻碍蒸汽的流通和热交换，使容器内升温减慢，造成物体内部杀菌不完全。

（四）升温过快

1.     原因：对温度升降过程的重要性认识不足，追求快速达到灭菌温度。

2.     后果：温度的升降过程同样起到杀菌的作用，升降温度过快会通过影响总的积温而影响灭菌效果。另外，升温过快，特别是使用外源蒸汽的情况下，会造成被灭菌物体内部升温滞后于压力表指示温度。

（五）灭菌物体体积过大

1.     原因：未根据灭菌物体体积合理调整灭菌时间。

2.     后果：组织培养中或常规微生物实验中，高温蒸汽灭菌通常要在 121℃（即蒸汽压力为 0.105MPa）下保温 15min，这一规定仅适用于试管、三角瓶中小于 200ml 容量的。若体积太大，特别是固体培养基，会造成灭菌不彻底，应适当延长灭菌时间。

（六）任意延长灭菌时间

1.     原因：为了“保证彻底灭菌”而忽视杀菌过程中温度对培养基成分的破坏作用。

2.     后果：规定的灭菌温度和时间是经过科学试验确定的，任意延长灭菌时间会破坏培养基成分，得不偿失。

（七）温度不稳定

1.     原因：手提式电能灭菌锅没有控温装置，难于控温；灭菌锅内加水太少；容器内装的溶液量过多；安全阀失灵等。

2.     后果：灭菌过程中温度（压力）忽高忽低，影响灭菌效果。

五、其他灭菌方法常见错误分析

（一）干热灭菌

1.     物品堆放不当

·        原因：将灭菌物品（如培养皿）堆摞放置，且堆得过满、过挤。

·        后果：阻碍空气流通和热量的传递、交换，导致灭菌不彻底。

2.     升温操作不当

·        原因：升温时不打开箱顶通风孔。

·        后果：影响箱内冷空气及水汽的排除，降低灭菌效果。

3.     高温开箱取物

·        原因：高温（80℃以上）下开箱取物。

·        后果：热蒸汽喷出造成烧伤及突然降温，使玻璃器皿破裂。

4.     温度过高

·        原因：温度过高（180℃以上）。

·        后果：造成包装纸、棉塞焦化，失去防菌或过滤作用。

5.     放入不耐热物品

·        原因：将不耐热的枪头、离心管、试管帽、滤器等塑料制品放入烤箱内灭菌。

·        后果：塑料制品熔化，损坏物品。

（二）灼烧灭菌

1.     灭菌范围不够

·        原因：接种工具的灭菌范围不够，如长度不够，灼烧时没有旋转。

·        后果：造成内外侧灭菌不匀，可能引入微生物污染。

2.     工具温度过高使用

·        原因：接种工具没有降至常温即用于接种。

·        后果：可能烫伤操作人员或对实验材料造成不良影响。

3.     过度灼烧玻璃器皿

·        原因：对玻璃器皿灼烧过度。

·        后果：使棉塞、封口膜焦化或熔化，影响使用。

六、结论

高压蒸汽灭菌锅的正确操作对于保证灭菌效果和实验安全至关重要。操作人员应严格遵守操作规范，注意排气、升压、降压等各个环节的细节，避免常见错误的发生。同时，对于干热灭菌和灼烧灭菌等其他灭菌方法，也应了解其常见错误及原因，采取相应的措施加以避免。