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化验员资格证化学检验员培训-分析检测中标准曲线的应用难点与误区解析

引言

分析检测的核心任务在于实现精准的定性与定量分析。定性分析旨在确认目标物质是否存在，而定量分析则致力于测定待测物质的具体含量范围。然而，无论是定性还是定量分析，均不可避免地伴随着不确定度，这是由分析检测的复杂性和多种干扰因素共同决定的。在分析检测领域，标准曲线作为一种普遍采用的方法，其本质在于揭示一系列已知含量（浓度或量）的物质与仪器响应/信号之间的内在联系。通过数学处理，可得到曲线方程；通过图形表示，则形成标准曲线。

标准曲线的本质与核心问题

标准曲线的本质

标准曲线是分析检测中不可或缺的工具，其本质在于建立已知含量物质与仪器响应之间的定量关系。通过数学处理，可得到曲线方程，进而通过图形表示形成直观的标准曲线。这一关系的建立，为后续根据仪器响应推算待测物质含量提供了科学依据。

标准曲线的核心问题

在构建标准曲线时，需解决两大核心问题：一是获取确切浓度的标准物质或标准品，这是确保标准曲线准确性的基础；二是确保标准系列与待测物质具有相同和一致的基体，以消除样品基体对仪器响应的干扰。样品前处理的目的即在于提供与标准物质相似的基体环境，从而减小基体干扰对定量结果的影响。为解决基体干扰问题，可采用标准加入曲线和Youden曲线进行考察。标准加入曲线通过在样品中加入一系列标准物质，考察标准加入曲线与标准曲线斜率的统计学差异，以判断是否存在乘积性干扰；Youden曲线则通过对样品进行一系列稀释，考察仪器响应与稀释倍数之间的关系，以判断是否存在加和性干扰。

标准曲线的制作方法与注意事项

标准曲线的制作方法

根据GB/T 22554-2010《基于标准样品的线性校准》的要求，制作标准曲线时需遵循以下原则：

1.     浓度范围覆盖：标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下的被测量范围，以确保标准曲线在整个测量范围内的有效性。

2.     组分一致性：标准样品的组分应尽量与被测样品组分一致，以减小基体干扰对定量结果的影响。

3.     浓度值分布：标准样品的浓度值应等距离地分布在被测量范围内，以提高标准曲线的线性度和准确性。

4.     标准点数量：标准样品的个数至少应有3个浓度点，以确保能够拟合出可靠的曲线方程。

5.     重复测定：每个标准点至少重复测定2次，以减小随机误差对定量结果的影响。

注意事项

在实际操作中，还需注意以下几点：

·        遵循国家标准：如果国家标准中有相应的浓度系列推荐，应尽量遵循国家标准进行制作。

·        理论标准支撑：在减少标准点数量时，应有理论标准支撑，如至少需要3个浓度点才能拟合出可靠的直线方程。

·        线性校准：由于线性方程最为简洁且易于处理，因此在实际工作中常采用线性校准方法。

标准曲线的检验方法与难点

标准曲线的检验方法

标准曲线的检验是实际操作中的难点之一，也是工作中误区和争议最多的话题。根据GB/T 5750.3-2006的规定，标准曲线的检验主要包括精密度检验、截距检验和斜率检验三个方面。

1.     精密度检验：精密度检验旨在考察试验点在拟合直线方程周围的分布情况。通过最小二乘算法（OLS）拟合出的标准曲线并非通过所有点，而是非常接近所有点。精密度检验即看这些试验点距离拟合直线的距离有无异常，因此也称为线性检验或拟合检验。通常采用F检验进行精密度检验，以P<0.05作为线性检验合格的标准。

2.     截距检验与斜率检验：截距检验和斜率检验分别考察Y=a+bX中a和b与0的统计学差异。若a与0有差别，则说明存在试剂空白或系统误差；若b与0无差别，则说明仪器的灵敏度根本达不到分析要求。

3.     决定系数与相关系数：决定系数是相关系数的平方，它提示的是建立的回归方程所解释的X对Y变化占Y变量的比值。虽然相关系数在一定程度上能够反映标准曲线的好坏，但并不全面。因为统计检验的临界值较大，通常0.90以上的相关系数都会通过F检验，但这并不意味着标准曲线在所有情况下都是可靠的。

4.     失拟检验：失拟检验旨在考察曲线拟合后剩下的残差与实验数据本身随机误差（变异）之间的差别。同样采用F检验进行失拟检验，要求失拟检验的P值应大于0.05，即残差应与实验测定中的随机误差（变异）没有差别。为进行失拟检验，需对每个浓度点至少重复测定2次。

5.     残差的正态性检验：除了线性检验和失拟检验外，还需考察残差的分布是否为正态分布。因为正态分布才符合随机误差的特性，从而确保标准曲线的可靠性。

标准曲线检验的难点

标准曲线检验的难点在于如何综合运用各种检验方法，以确保标准曲线的准确性和可靠性。由于各种检验方法均有其局限性和适用范围，因此在实际操作中需根据具体情况选择合适的检验方法，并结合多种检验方法进行综合判断。

标准曲线使用中的常见问题与解答

问题1：标准曲线需要人为增加（0,0）点吗？

解答：不能。通常的标准系列多是配制如0,1,2,3mg/L的系列浓度点。人为添加（0,0）点而不进行实验是不妥的，因为很多时候0管进入仪器也可能产生响应值，这是考察试剂空白的重要步骤。例如，在全血铅测定中，若采用牛血清来基体匹配标准系列，此时若用酸做空白或未做实验而人为添加（0,0）点，则难以做好标准曲线。因此，标准曲线的0管也是做好标准曲线的重要考虑点。

问题2：标准曲线需要减掉试剂空白来做吗？

解答：不需要。仪器测出的标准系列响应值可以减掉试剂空白或0管的响应值来进行处理，工作中也常用0管来进行仪器调零。然而，实际上没有必要那么麻烦。即使空白或0管有响应值，在构建标准曲线时，已默认该响应值即为0浓度时的响应值，即已扣除了空白的影响。

问题3：何时使用Y=bX和二次曲线？

解答：标准曲线通常采用Y=a+bX的形式进行拟合。拟合完成后，必须进行统计检验，包括线性检验和失拟检验。然后，再进行a与0的差别检验。若a与0在统计学上无差异，则可考虑使用Y=bX的拟合曲线。同样，拟合完成后也需进行线性检验和失拟检验。若线性检验合格（P<0.05）且失拟检验合格（P>0.05），则可采用Y=bX的形式。二次曲线的采用也是基于同样的道理。若Y=a+bX拟合不合格，则可考虑使用Y=a+bX+cX²的形式进行拟合，并同样进行失拟检验以考察拟合的符合情况。若Y=a+bX和Y=a+bX+cX²均满足拟合检验和失拟检验合格，则应采用Y=a+bX的形式，以符合统计学上参数最少的简洁性原则。

问题4：标准曲线查含量时是先减空白信号还是先算出空白含量相减？

解答：在工作中，常需要减掉空白以得到样品含量。现有国家标准方法中，有的推荐先算出空白含量，再用样品含量相减；也有推荐先用样品信号减空白信号，然后去标准曲线推算含量。这两种方法在低含量水平时常常差距较大，因为在低含量水平下，通过标准曲线推算含量时的不确定度本身就很大。实际上，这两种方法均可采用。但个人推荐先用样品信号减空白信号，然后去标准曲线推算含量。因为这样得出的含量不确定度要小一些。而先算出空白含量再相减，则增加了1次标准曲线推算含量时的不确定度。因为好的测量永远是不确定度小的测量。

问题5：如何进行两条标准曲线的检验？

解答：判断两条或多条标准曲线的差异时，需检验残差、截距和斜率三项指标，分别采用不同的统计学参数进行检验。残差采用F检验进行检验；截距和斜率则采用较为复杂的统计量进行检验。从实际操作角度讲，多用协方差分析来检验截距和斜率的差异。以SPSS软件为例，具体操作步骤如下：

1.     重新整理数据，将y2数据列加到y1下面，变成一个变量y；将x2数据列加到x1下面，变成一个变量x；然后设定一个新的分组变量group，原来第1组值为1，第2组值为2。

2.     进行协方差分析（第一步分析斜率是否无差异）。选择Analyze->General Linear Model->Univariate，在Dependent List中填入y作为因变量，在Fixed Factor中填入group，在Covaraites中填入x作为协变量。在Model中选择Custom，并填入x group xgroup（注意变量填入顺序不同会导致结果不同）。在Sum of squares下拉列表框中选择Type I，然后点击ok。查看结果中xgroup这一行的Sig.P值。若大于0.05，则接受原假设，即两条回归直线的斜率无差异；否则拒绝原假设。

3.     进行截距的无差异分析（过程与斜率分析类似，只是Model中去掉了x*group交叉项）。选择Analyze->General Linear Model->Univariate，在Dependent List中填入y作为因变量，在Fixed Factor中填入group，在Covaraites中填入x作为协变量。在Model中选择Custom，并填入x group（注意变量填入顺序不同会导致结果不同）。在Sum of squares下拉列表框中选择Type I，然后点击ok。查看结果中group一行的Sig.P值。若P值大于0.05，则说明两条回归直线的截距也无差异；若小于0.05，则说明截距存在差异。

问题6：标准系列的标准溶液体积取用中有效数字该如何写？

解答：标准溶液体积取用的有效数字与采用的体积量具有直接关系。例如，“量取”或“准确量取”等字眼提示了不同的精度要求。10mL和10.0mL提示要采用不同的量具进行量取。当使用某个量具完成某次体积取用后，读数是按照量具的最小允差决定的。而最小允差是针对最小分度线而言的。例如，当取用10mL体积时，若使用A级10mL的分度吸管，则10.0mL应为确定的读数，因为其分度线为0.1mL。当取用1mL体积时，若使用A级1mL的分度吸管，则1.00mL应为确定的读数，因为其分度线为0.01mL。因此，个人意见认为，到底写10.00还是10.0应以最小分度线来确定，最小分度线以下的都为估读。若认为估读也是有效数字的话，则10.00mL也可接受（因为此时的容量允差为0.05mL），但1.000mL则没有太大意义，因为A级1mL的分度吸管的容量允差已经是0.008mL了。

问题7：标准曲线的相关系数的有效数字该如何保留？

解答：根据GB 5750.3-2006中8.2.7项的规定，校准曲线相关系数应只舍不入，并保留到小数点后出现非9的一位数字。例如，0.99989应保留为0.9998。若小数点后都是9，则最多保留小数点后4位数字。

问题8：标准曲线可以用同一浓度不同体积的进样来做吗？

解答：标准系列一般都是配制不同浓度、进样相同体积来做的（浓度法）。但实际工作中，还可用同一浓度来进样不同体积的方式来做（体积法）。浓度法与体积法的区别在于：浓度法中与待测物质存在的溶剂/待测物质的比例与体积法不同。浓度法中溶剂的环境（体积）基本是一致的，这有利于在判断溶剂（或溶剂中干扰物质）和待测物质的指认上更加容易。而体积法中干扰物质也会随标准系列增加，不易实现待测物质的指认。此外，进样针在进小体积时的不确定度较大，导致标准曲线不如浓度法容易做直。且受物理体积的限制，体积法不太容易实现较大跨度的浓度系列设置。总之，体积法和浓度法本质上是一致的，但浓度法具有容易做好标准曲线、容易实现较大浓度跨度和容易实现待测物质的指认等优点。

问题9：标准曲线查出样品是负值时如何报告结果？

解答：当标准曲线查出样品为负值时，一般可选择四种方式报告结果：未检出、<检出限、<定量限、<标准曲线第一点所推算的样品浓度。这四种方式均有其道理，但实际区别在于结果报告人所承担的风险不同。未检出的全部含义应是本实验室本仪器本方法未检出。若没有这些界定，则未检出的歧义较多，且未提供其他任何可用的信息。因此，建议一般不采用这种报告方法。检出限是定性检出的标志，它是与空白的统计比较计算出来的。每台仪器每次测定均有其检出限。检出限的计算目前有两大类方法：单浓度方法和校正设计法。常规采用的单浓度方法需要额外的工作，因此现在趋向于使用校正设计法，即利用标准曲线直接计算检出限。定量限是可以定量检出的标志，其RSD定为10%，其II类错误比检出限小很多。<标准曲线第一点所推算的样品浓度是仪器比较可信的测定浓度。总之，报告<检出限、<定量限、<标准曲线第一点所推算的样品浓度所犯I类和II类错误依次降低。但若这个报告结果已超过要判断的限值，则检测就失去意义了。因此，现在的检测单位甚至直接报告小于国家标准规定的限值，从概率统计的角度讲，它犯错误的几率最小，但又解决了客户的检测问题。

问题10：空白测出来是负值时该不该减？

解答：空白代表所选择的空白对仪器响应/信号的影响，可能是正方向或负方向的影响。因此，理论上讲必须减掉空白。至于是先减空白信号还是减空白测定值，则应按国家规定进行操作。

问题11：线性范围（动态范围）的最低点和最高点如何确定？

解答：配制一系列浓度标准（包括0浓度），从低浓度开始拟合。当拟合检验出现P>0.05的最高浓度点即为线性范围的上限。也有经验认为，当加入的高浓度点在低浓度点构建的直线方程推算的响应超出±10%范围时，该点即为线性范围的上限。关于线性范围的最低点，应是0、检出限或是定量限的问题，个人趋向于将最低点设为0。因为线性范围只是统计学上线性的表现，与能否准确定量是两方面的问题。

总结

标准曲线在分析检测中具有举足轻重的地位。然而，在实际应用过程中，标准曲线的制作、检验和使用均存在诸多难点和误区。本文通过对标准曲线的本质、核心问题、制作方法、检验方法以及使用中的常见问题进行深入探讨，旨在为分析检测人员提供有益的参考和指导。